蛋白質含量測定不同方法的比較

蛋白質含量測定是生化研究中最常用和最基本的分析方法之一。 目前常用的古代經典方法有四種，分別是氮測定法、雙收縮尿法（縮二脲法）、福林酚試劑法（Lowry法）和紫外線吸收法。 還有一種在過去十年中才被普遍使用的新檢測方法，即考馬斯亮藍法（布拉德福德法）。

其中，Bradford法和Lowry法的靈敏度最高，比紫外線吸收法靈敏度高10 20倍，靈敏度比Burine法高100倍以上。 雖然氮測定方法比較複雜，但更準確，用氮測定法測定的蛋白質常被用作其他方法的標準蛋白質。

需要注意的是，這最後四種方法不適用於任何條件下任何形式的蛋白質，因為對於由這四種方法確定的蛋白質溶液，可以給出四種不同的結果。 每種檢測方法都不完美，各有優缺點。 選擇方法時，應考慮：

測定所需的靈敏度和精密度; 蛋白質的性質; 溶液中存在的干擾物質; 確定所需的時間。

考馬斯亮藍法（布拉德福德法）由於其突出的優點而得到越來越廣泛的應用。

1.凱氏定氮法測定法。

凱氏定氮法由丹麥開發。

由化學家凱達爾於1833年創立，現已發展成為恆定、微觀、平坦和微觀凱氏定氮法和自動定氮法，是分析有機化合物氮含量的常用方法。

凱氏定氮法基於這樣乙個事實，即蛋白質中的氮含量通常約為其總質量的 16%，因此可以通過測量物質中的氮含量來估計物質中的總蛋白質含量（假設被測物質中的所有氮都來自蛋白質），即， 蛋白質含量 = 16% 氮含量。

2.紫外吸收光譜。

紫外吸收光譜法，也稱為紫外分光光度法，是基於紫外光的不同波長，具體取決於物質。

一種分析具有不同吸收程度的物質組成的方法。 該方法使用的儀器是紫外吸收分光光度計。

或紫外-可見吸收分光光度計。

光源發出的紫外線。

通過光柵或稜鏡進行光譜分析後，分別通過樣品溶液和參比溶液投射到光電倍增管上，經過光電轉換和放大後，紫外吸收光譜可用於物質的定性分析。

蛋白質的測定方法可分為兩類：一是利用蛋白質的共性，即氮含量、肽鍵和折射率來測定蛋白質含量; 另一種是利用蛋白質中特定的氨基酸殘基、酸性和鹼性基團以及芳香族來測定蛋白質含量。 常見的方法有：

凱氏定氮法、縮二脲法、苯酚試劑法和紫外線吸收法。

1.凱氏定氮法。

製備4個50ml凱氏定氮燒瓶並貼上標籤，將定量蛋白質樣品加入燒瓶中，另外兩個燒瓶作為對照，每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，然後加入濃硫酸，將4個燒瓶放在消化架上進行消解，然後進行蒸餾，蒸餾完畢後，用標準鹽酸滴定每個燒瓶中收集的氨的量，直到指示劑混合物由綠色變回淡紫紅色，這是滴定的終點，蛋白質含量沉澱。

2.利脲法。

利脲法首先通過比色法測定蛋白質濃度，硫酸銨不干擾顯色，Cu2+與蛋白質的肽鍵以及酪氨酸殘基絡合形成紫藍色絡合物，在540 nm處吸收最大。 首先，用標準蛋白溶液和縮二脲試劑繪製標準曲線，將待供試血清與試管中的硫酸鈉混合，以僅含硫酸鈉而不含血清的試管為對照，將兩個試管加入等量的縮二脲試劑中， 充分混合，置於37環境中10分鐘，在540nm波長下進行比色法，對照管歸零，讀取吸光度值，直接從標準曲線檢測蛋白質含量。縮二脲法常用於測定蛋白質溶液的含量。

3.酚類試劑法。

取6支試管並分別標記，前5支試管加入不同濃度的標準蛋白溶液，最後一支試管加入待供測蛋白質溶液，不加入標準蛋白溶液，加入蒸餾水使每支試管中的液體總量一致， 將液體混合均勻，室溫放置30分鐘，以第一試管無蛋白溶液為空白對照，在650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4.紫外線吸收。

大多數蛋白質在280nm波長處具有特徵性的最大吸收，這是由於蛋白質中存在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，可用於確定蛋白質溶液的含量。 取9個試管分別標記，前8個試管加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加入標準蛋白溶液，最後乙個試管加入待供測蛋白質溶液，不加入標準蛋白溶液，加入蒸餾水使每個試管中的液體總量保持一致， 將液體混合均勻，在280nm波長下進行比色，並記錄吸光度值。

5.其他。 除上述方法外，考馬斯亮藍法和地喹啉羧酸法也可用於蛋白質測定。

凱氏定氮法原理：蛋白質平均含氮量為16%。

當樣品與濃硫酸共熱時，蛋白氮轉化為銨鹽，氨在強鹼性條件下蒸發，用指示劑用硼酸吸收，最後用標準酸滴定硼酸，蛋白質中的氮含量和蛋白質含量可以通過標準酸的量來求。

蛋白質濃度由布拉德福德法測定。

1）實驗原理。

縮二脲法和亞葉酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多侷限性促使科學家尋找更好的雞蛋。

白質溶液的測定方法。

考馬斯亮藍法（布拉德福德法）由布拉德福德於1976年建立，是根據蛋白質結合染料的原理設計的。 這種蛋白質。

質量檢測被廣泛使用，因為它們比其他幾種方法具有突出的優勢。 這種方法是目前最靈敏的蛋白質測定方法。

法律。 考馬斯 G-250 染料與酸性溶液中的蛋白質結合，使染料的最大吸收峰（最大）的位置從 465nm 變為 595N

M，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。

吸光度值A595在595nm處測定，與蛋白質濃度成正比。

布拉德福德方法的突出優點是：

1） 靈敏度高，估計比 Lowry 方法高約 4 倍，最小蛋白質檢測體積高達 1 g。 這是因為蛋白質是在與染料結合時產生的。

顏色變化很大，蛋白質染料複合物具有較高的消光係數，因此與Lowry法相比，吸光值隨蛋白質濃度的變化更大。

多。 （2）測定快速簡便，只需新增一種試劑。 只需約5分鐘即可完成樣品的測量。 由於染料與蛋白質結合。

該過程大約需要 2 分鐘才能完成，顏色穩定 1 小時，在 5 分鐘到 20 分鐘之間，顏色穩定性最好。

因此，不需要像 Lowry 方法那樣耗時且嚴格的時間控制。

3）干擾物質少。例如，K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩衝液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾Lowry方法。

干擾該測定。

1.凱氏定氮法測定法。

凱氏定氮法由丹麥化學家凱德爾於1833年創立，現已發展成為恆定、微量、平整和微量凱氏定氮法和自動氮素測定法等，是分析有機化合物氮含量的常用方法。

凱氏定氮法基於這樣乙個事實，即蛋白質中的氮含量通常約為其總質量的 16%（12% 至 19%），因此可以通過測量物質中的氮含量來估計物質的總蛋白質含量（假設被測物質中的所有氮都來自蛋白質）， 即蛋白質含量=氮含量16%。

2.紫外吸收光譜。

紫外吸收光譜法又稱紫外分光光度法，是一種根據不同波長的紫外吸收程度來分析物質成分的方法。 該方法中使用的儀器是紫外吸收分光光度計或紫外-可見吸收分光光度計。

光源發出的紫外光經光柵或稜鏡分隔，然後分別通過樣品溶液和參比溶液投射到光電倍增管上，經過光電轉換放大後，繪製出的紫外吸收光譜可用於物質的定性分析。

測定蛋白質含量的常用方法如下：

1.凱氏定氮法是一種通用的蛋白質定量方法，可以測定氮含量，甚至可以測定微量有機氮，在測定蛋白質含量方面操作簡單，檢測效率高，GET準確率高。 該方法以氫氣為氮源，氨與硫酸一起釋放，氨鹼中的氨與硫酸鈉一起攜帶，然後緩衝和蒸發水解，最後通過苯酚釀造定量氮氣，形成深藍色絡合物，從而間接得到蛋白質含量。

2.Bradford法也是一種多用途方法，可直接測定蛋白質中的色氨酸和膽紅素含量，該方法操作簡單，成本低，測試效率高，可在一小時內獲得高精度的測量結果。 布拉德福德方法基於蛋白質及其沉澱物與二價鉻 J 複合物結合的原理，從而形成光電特異性比色反應。

3.洛瑞法也是一種多功能定量法，該法可以測定有機物中蛋白質、氨基酸等氮的氮含量，以及各種物質中的親和菌，操作過程簡單，準確率也高，比凱氏定氮法快7倍以上，洛瑞法的原理是將蛋白質分解成氨基酸， 通過色色比色反應，將基材絡合工藝為蘆葦磨自絡金屬，再經冷醯菌素處理，在醯基騰中形成顏料降解形成比色螢光，定量檢測氮含量。從而間接獲得蛋白質含量。