使用前如何處置HPLC級流動相的簡要說明

用流動相稀釋樣品的主要目的是提高分離度，增加理論板的數量，使峰形尖銳對稱。 具體原因如下：

色譜的本質是樣品在流動相和固定相之間反覆分布的過程，在實踐中會受到許多因素的影響，導致分離度下降，理論板數減少，分離效果不理想。

根據液相色譜范德姆特方程h=a+c（a為渦擴散係數，c為傳質阻抗係數，為流動相流速）。

渦流擴散主要是由色譜柱本身引起的。

傳質阻抗是阻礙分子為實現固定相和流動相之間的平衡而吸附、解吸、溶解和擴散的因素。 在理想狀態下，如果色譜柱的傳質阻抗為零，則組分分子流動相與固定相之間的平衡將迅速達到，並且在實際系統中傳質阻抗不會為零。 用流動相溶解稀釋後的樣品的目的是降低傳質阻抗，增加分離板的數量，使峰尖銳對稱。

反相高效液相色譜的固定相為非極性溶劑，常用固定相為十八烷基鍵二氧化矽，常用相為極性溶劑，常用流動相為甲醇和乙腈。

反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相組成的液相色譜系統，與極性固定相和弱極性流動相（正相色譜）組成的液相色譜系統相反。

RP-HPLC的典型固定相是十八烷基鍵合二氧化矽，典型的流動相是甲醇和乙腈。 RP-HPLC是當今液相色譜最主要的分離方式，可用於分離幾乎所有可溶解在極性或弱極性溶劑中的有機物。 反相色譜適用於非極性、極性或離子化合物的分離，大部分分析任務由反相色譜法完成。

高效液泉相色譜法。

流動相的基本要求是：

1）待測樣品的溶劑。必須具有正確的極性和良好的選擇性。

2）應更換溶劑以匹配檢測器。對於紫外吸收檢測器，應注意檢測器的波長比溶劑的紫外截止波長長。 所謂溶劑的紫外截止波長，是指當小於截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對這種輻射的吸收性很強，認為溶劑是光學不透明的，嚴重干擾了組分的吸收測量。

對於折光率檢測器，必須選擇與組分折光率相差很大的溶劑作為流動相，以達到最高的靈敏度。

3）純度高。由於高效能液相的高靈敏度，對流動相溶劑的純度也提出了要求。 不純的溶劑會導致基線不穩定，或產生“虛假峰”。 痕量雜質的存在將使截止波長值增加 50 ioonm。

1.流動相恢復到室溫後使用。 當流動相的溫度與室溫不同時，流動相在恢復到室溫之前很難穩定基線水平，特別是發生漂移和容易產生氣泡的情況。 當水與有機溶劑混合時，混合物變化很大，並且經常與室溫相差很大，因此需要注意。

2、HPLC流動相試劑應為HPLC級，水應用二次蒸餾水蒸餾，水性流動相應經常更換，防止長菌變質。 不適合使用去離子水、注射水和純淨水（用於烹飪），尤其是在梯度洗脫時，因為水中的雜質會變成鬼峰並干擾分析結果。

3、流動相pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩衝溶液，使用離子對試劑等，都可能導致色譜柱填料發生化學破壞，對色譜柱固定相和鍵合相的損壞通常是無法修復的。

4、使用緩衝鹽作為流動相時，使用前後用水清洗流路，絕對禁止將緩衝溶液留在流路中靜置或長時間放置。

5.更換兩個不相容的流動相時，中間應用異丙醇溶液清洗過渡液。 例如，先用甲醇水作為流動相，再用正己烷作為流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，再用正己烷沖洗異丙醇，反之亦然。

還要考慮更換流動相時是否會更換色譜柱。

HPLC中使用的流動相必須提前脫氣，否則氣泡很容易在系統中逸出，影響幫浦的執行。 氣泡也會影響色譜柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使其無法檢測。

噪音增加，基線不穩定，突然跳躍。 此外，溶解在流動相中的氧氣可以與樣品、流動相甚至固定相（例如烷基胺）發生反應。 溶解氣體還會導致溶劑pH值發生變化，從而導致分離或分析結果出現錯誤。

常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲波、吹氦等。

高效液相色譜是色譜的乙個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸注系統，將不同極性或不同比例的單一溶劑、緩衝液等流動相幫浦入裝有固定相的色譜柱中，分離柱內各組分後， 他們進入檢測器進行檢測，從而實現對樣品的分析。

複製脫氣以擺脫流動。

相位中的氣泡受到攻擊，因此氣泡不會干擾測量。

常用關。

反相是指流動相比固定相更具極性的液相色譜法。

反相中最常用的是C18色譜柱，最常用的流動相是乙腈、甲醇、水，還可以新增一些其他的東西，如磷酸鹽、酸或胺類，也可以新增活化劑，視分析的需要而定。

使用液相色譜中使用的移動肢體時應注意以下問題

盡量使用高純溶劑作為流動相，防止痕量雜質長期積累，損壞色譜柱，增加檢測器雜訊。 不純的溶劑會導致基線不穩定並產生假峰。 避免流動相與固定相的相互作用，從而降低色譜柱效率，損壞色譜柱，如溶解固定溶液，氧化鋁固定相被酸性溶劑破壞。

樣品在流動相中應具有適當的溶解度，以防止沉澱和沉積在色譜柱中。 流動相具有低粘度（中等粘度）。 如果使用高粘度溶劑，壓力會增加，不利於分離。 常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等。

但是，粘度過低的溶劑，如戊烷，也不適合使用，因為它們容易在色譜柱和檢測器中形成氣泡，影響分離。 良好的化學穩定性。 因此，流量滿足檢測器的要求。

對於紫外吸收檢測器，應注意選擇比溶劑的紫外截止波長更長的檢測器波長。

所謂溶劑的紫外截止波長，是指當小於截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑會強烈吸收這種輻射，而溶劑被認為是光學不透明的，這可能會嚴重干擾組分的吸收測量。 對於折光率檢測器，需要選擇組分折光率差異較大的溶劑作為透明流動相，以達到最高的靈敏度。

原則和分類

液相色譜法的分離機理是基於混合物中各組分親和力的差異。 根據固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。 使用最廣泛的是二氧化矽基液固色譜法和微矽基鍵合相色譜法。

根據固定相的形式，液相色譜法可分為柱層析法、紙層析法和薄層色譜法。 按吸附力可分為吸附色譜法、分割色譜法、離子交換色譜法和凝膠滲透色譜法。 近年來，由於在液柱色譜系統中增加了高壓液流系統，使流動相在高壓下快速流動，提高了分離效果，因此出現了高效液相色譜。