在Western Blot中孵育一抗時，是否可以同時孵育多個一抗？

理論上是可以的，而且網上也看到一些網友聲稱他們已經這樣做了。 然而，不同的一抗是否相容，以及它們應該新增多少，這些條件都需要專門探索和優化。 優化過程本身涉及分別採用每種一抗，以確定條帶的位置以及在不受干擾的條件下特定樣品中的背景。

所以除非這個實驗 1對於房東來說，要大量實施，重複實施，找出大規模應用的條件; 或 2地主樣品太珍貴了，得到的量不能用於多次免疫印跡實驗，必須在乙個膜上獲得盡可能多的抗體結果，否則如果算上優化的精力和成本，一般不值得做。

可以同時孵育多種一抗，但有幾點需要牢記：

1.確保使用的試劑和緩衝液不會與抗體發生交叉反應或干擾。

2.確保每次抗體孵育的條件和時間相同，避免抗體之間的不正當競爭。

3.在孵育多種抗體時，需要適當增加抗體的使用量，以確保每種抗體與其對應抗原充分結合。

4.在隨後的洗滌步驟中，需要使用適當的洗滌緩衝液以避免抗體之間的交叉反應。

綜上所述，可以同時孵育多種一抗，但需要注意保持孵育條件的一致性，避免抗體之間的交叉反應。

如果您的一抗是特異性的，是的。 最好將它們全部與相同的溶液混合，例如牛奶或 BSA

SDS-PAGE電泳前，將一般樣品加入上樣緩衝液中，煮沸5-10分鐘，使蛋白質樣品變性並攜帶一定電荷，使蛋白質遷移速率僅與分子量有關，從而通過電泳盡可能區分不同的蛋白質。 在這個過程中，一些分子相互作用，包括抗體和蛋白質樣品之間的相互作用，被打斷了，也許沒有人這樣做。

一抗是完全的蛋白質，如果與樣品混合，即使是一抗在樣品煮沸變性時也會分解成多肽，PAGE電泳後也會變成條帶，完全失去作用。

我考慮了是否可以直接與蛋白質樣品一起孵育，然後與二抗一起孵育，加入化學發光劑，然後在酶標儀中取一定量的樣品進行分光光度法測量，並根據測量結果分析目標蛋白質的增加或減少。 我不知道這是否可以。 但這似乎已經成為ELISA實驗的複雜版本......

然後你的一抗也會變性，二抗無法識別其空間表位。

當然，Western blot一抗孵育4小時是有效果的，一抗孵育時間過長容易導致非特異性吸附加深。

一般可在室溫下孵育30分鐘，再孵育4夜。 或者，選擇將直接二抗在室溫下孵育 2 小時。 由於洗滌膜會洗掉未結合的抗體，因此不容易洗掉抗體結合。

如果薄膜沒有完全洗淨，背景會很深，但延長的洗膜時間不會完全去除背景。

是的，一抗應該用封閉溶液稀釋。 但是，請記住在將膜放入封閉溶液中之前用TBST清洗膜，以免殘留的轉移液影響抗原抗體結合。

根據你用來阻止它的東西，如果你使用5%的牛奶或1%的BSA，這是可以的。

相當於延長了一抗的孵育時間，一些二抗被過量的一抗結合浪費了，在二抗孵育清洗時，版本會因為一抗沒有清洗，沒有結合膜，但很可能應該與二抗結合的一抗不會接觸與二抗或不均勻，導致條帶不清晰和異常，以及強烈的非特異性背景。

沒關係。 我已經這樣做了，如果電泳很好，條帶會可見，但整體亮度會更弱。 如果一抗沒有問題，建議下次可以新增陽性蛋白作為對照，看看是否有問題。

祝你實驗好運！

原則上二抗可以再次孵育而沒有效果，但二抗一般孵育1-2小時就足夠了，可能不會再變孵育，不知道怎麼判斷一抗沒有問題。

將一抗孵育過夜。

操作：下班後 - 孵育一抗 - 將其放入4冰箱 - 第二天上班孵育二抗。

時間 8 到 10 小時，全部線上

將一抗在 4 度下孵育過夜 12 至 16 小時