蛋白質印跡法的工藝和原理

Western blot法採用聚丙烯醯胺凝膠電泳，分析物為蛋白質，將聚丙烯醯胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品轉移到固體載體中，電泳分離的肽型別及其生物活性可保持不變。

以固相載體上的蛋白質或肽為抗原，對應抗體進行免疫反應，再與酶或同位素標記的二抗反應，通過底物顯色或放射自顯影法檢測經電泳分離的特異性靶基因所表達的蛋白質成分。

相關性如下。 原理：先製備蛋白質樣品，然後利用SDS-PAGE原理分離不同的蛋白質，然後將分離出的蛋白質轉移到膜上，以便將它們固定在新的膜上進行抗原抗體結合。

固定在膜上的蛋白質用作抗原，與相應的非標記抗體（一抗）結合。

由於在此過程中可能會殘留一些不與抗原結合的抗體，因此需要清潔以保留特異性結合的抗原-抗體偶聯物。 抗原-抗體偶聯物暴露乙個 FC 片段，相應的二抗可以與其結合形成抗原-一抗-二抗偶聯物。

然後用相應的過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記二抗，由於新增的標記物在質分子中比較大，可以通過離心沉澱，如果抗原和抗體結合，它們可以一起沉澱，最後可以通過顯色反應或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白質成分。

Western Blot的原理：簡單來說，其原理是通過特異性抗體對用凝膠電泳處理的細胞或生物組織樣品進行著色。 通過分析染色的位置和深度，可以獲得有關所分析細胞或組織中特定蛋白質表達的資訊。

Western blot，中文為Western blot，簡稱抗原-抗體特異性結合。

Western blot結果背景高的原因和建議：

膜封閉不足 – 延長密封時間; 選擇更合適的封閉介質。 不適當的一抗稀釋—測試抗體滴度以選擇最合適的抗體稀釋度。 一抗孵育溫度偏高，建議結合過夜。

膜在實驗過程中已經乾燥，在實驗過程中應注意保持膜濕潤。 檢測時間過長 - 縮短時間。

Western blot的原理如下：

蛋白質印跡是一種常用的蛋白質分析技術，它通過從複雜的蛋白質混合物中分離蛋白質並對其進行定量來確定蛋白質的存在和表達水平。 蛋白質印跡技術包括樣品製備、蛋白質分離、轉膜、蛋白質檢測和分析等步驟。

1. 樣品製備和蛋白質分離

首先，需要從細胞或組織中提取目標蛋白，通常使用細胞裂解和蛋白提取試劑盒來破壞細胞膜並釋放蛋白。 然後通過離心等步驟純化和富集提取的樣品，以消除雜質和其他蛋白質的干擾。

2. SDS-PAGE凝膠電泳

根據蛋白質的分子量從樣品中分離蛋白質是蛋白質印跡的關鍵步驟。 聚丙烯醯胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 通常用於此目的。 在SDS-PAGE中，通過電泳將蛋白質樣品根據其分子量分離成條帶，以使其通過凝膠遷移。

3.轉移到膠片開始土地

SDS-PAGE分離完成後，需要將蛋白質從凝膠靜靜地轉移到膜上，以進行後續的免疫測定。 此步驟稱為電轉印，通常使用半乾式烘箱或濕式轉印系統完成。

通過向蛋白質施加電流，蛋白質從凝膠轉移到膜上。 常用的轉印膜包括聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素膜。

4. 蛋白質檢測與分析

將蛋白質轉移到膜上後，需要進行蛋白質檢測和分析。 第一步是阻斷，即使用蛋白質結合抑制劑阻斷膜上的非特異性結合位點，以避免免疫測定的背景干擾。 第二步是免疫測定，其中特異性抗體與目標蛋白結合，並使用標記的二抗或酶標記的抗體進行檢測。

5. 結果分析和資料採集

蛋白質的存在和表達水平資訊可通過蛋白質印跡法獲得。 這可以通過觀察免疫測定結果中的蛋白質帶來判斷。 使用成像系統（例如化學發光系統或紫外成像系統）獲取影象，並使用影象分析軟體進行量化。

蛋白質印跡

WB 是一種將電泳分離的組分從凝膠轉移到固體載體（NC 或 PVDF 膜）並使用特定氨基酸序列特異性試劑作為探針進行檢測的過程。 WB 使用抗體作為探針，該探針可以進行抗原抗體免疫反應，靶蛋白的表位附著在固體支援物上。 該技術的目的是鑑定和半定量從細胞或組織中提取的蛋白質混合物（即總蛋白質混合物）中的特定蛋白質，目的是鑑定特定蛋白質的型別（例如，亞型、mer、剪接體等）和蛋白質表達的變化。

基本流程如下：

我們已經介紹了SDS-PAGE，如果您想在電泳後進行蛋白質印跡，則需要轉移膜。

轉印：有兩種不同的轉印方法：濕式轉印和半乾式轉印。 我採用半乾轉印法，用膠水覆蓋膜，用平衡緩衝液（甲醇溶液）潤濕膜，分別用頂部緩衝液和底部緩衝液潤濕蓋子，轉移膜10min。

注：1：膜尺寸合適，防止浪費。

2：覆蓋膜和凝膠後，凝膠和膜應壓平，否則會導致轉印不完全。

3：一定要戴上手套或塑料鑷子接觸薄膜，避免手上的蛋白質和油脂降低轉印效率。

阻斷：減少背景，佔據膜上剩餘的結合位點，使抗體只能與膜上的抗原特異性結合，一般使用5%的脫脂奶粉，但值得注意的是，對於磷酸化抗體或生物素化抗體，不能使用脫脂奶粉，只能使用5%的BSA。 封口時間：室溫1-2h。

一抗孵育：封閉後，用PBST微洗膜倒出，然後加入PBST搖勻10min，洗滌3次後加入一抗+3%奶粉孵育2h，一般為5ml，但上次用的是10ml。 孵育一抗時，注意一抗的種類**，我用的是HIS標籤，所以一抗是抗HIS的。

一抗可重複使用2-3次。

PBST解決方案 PBS解決方案與吐溫。

洗膜：用PBST洗膜，10min次，洗滌3-4次。

二抗孵育：洗膜完成後，加入二抗+3%奶粉5ml，孵育1h，再次洗膜。 注意二抗的種類應該對應於一抗的**，例如，我的一抗是小鼠抗體，我的二抗是綿羊抗小鼠。

檢測：將顯影液中的液體A和液體B按1：1的比例吸收，混合在ml EP管中，100L一塊膠水，然後將混合物均勻滴加在PVDF膜上，用塑膠袋密封PVDF膜，放入顯影劑中顯影（速度要快，儘量減少基板消耗）。

蛋白質印跡實驗的程式如下：

1.準備樣品。

1）製冰並準備乙個冰盒。

2）製備細胞裂解液：根據細胞數確定所需的裂解液：50ul六孔板和一孔。

裂解物配方：100ul碧雲田裂解物+1ul蛋白酶抑制劑混合物+1ulpmsf

3）根據實驗需要製備細胞：取出培養基，用1PBS洗滌3次（從培養基中取出血清），向每個孔（6孔板）中加入適量的裂解液。快速刮掉細胞並將它們轉移到試管中，放在冰上20分鐘，搖晃並混合，然後在冰上再放置10分鐘。

2.SDS-PAGE聚丙烯醯胺凝膠電泳：製備分離凝膠（5ml凝膠）。

3.膜轉移。

1）切開膠水，根據記號筆的說明書和靶帶的位置切開膠水（注意膠水的邊角有標記），將洗脫後的膠水浸入轉印緩衝液中15分鐘。

2）PVDF膜打標後，將其浸入甲醇中1分鐘，然後與4張3mm濾紙和海綿一起浸入轉印緩衝液中浸泡15分鐘。

組織（小鼠十二指腸）蛋白提取。

製備方法：研磨珠、離心管、生理鹽水、RIPA蛋白裂解物、蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑、移液槍、吸頭、手套、冰、渦旋儀、離心機4臺;

將蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑加入到RIPA蛋白裂解物中（根據說明書確定新增量）。

2.研磨：將RIPA蛋白裂解物300 L提前分裝在離心管中，放入2個研磨珠中，稱取樣品約100mg，置於均質器中充分研磨;

3.蛋白質裂解：將樣品在冰上裂解2小時，在此期間在渦旋振盪器**上裂解2-3次;

4.蛋白質收集：將裂解的樣品以4 12,000rpm離心10分鐘，取上清液並將其放入新的EP管中以備後用。

蛋白質印跡法的處理過程如下：

1. 收集蛋白質樣品製備

細胞裂解物用於裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。 然後測定每個蛋白質樣品的蛋白質濃度。

2. 電泳

1）SDS-PAGE凝膠製備。SDS-PAGE凝膠（分離凝膠和堆積凝膠）可以參考一些文獻來製備。

2）樣品處理。向採集的蛋白質樣品中加入適量的濃縮SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液。 例如，2x 或 5x SDS-PAGE 蛋白上樣緩衝液。

3. 轉讓

1）我們建議使用PVDF膜進行蛋白質實驗。也可以使用硝酸纖維素膜（NC膜），但硝酸纖維素膜在操作過程中易碎，特別是在鑷子時容易開裂。 請參閱製造商推薦的膜使用程式。

通常，如果使用 Bio-Rad 的標準濕式傳輸單元，傳輸電流可以設定為 300-400mA。

2）在轉膜過程中，特別是大電流快速轉膜時，通常會出現非常嚴重的發熱現象，最好將轉印槽放在冰浴中進行轉膜。在所使用的預染蛋白分子量標準中可以觀察到轉移的效果，並且通常很難將分子量最大的1-2條帶全部轉移到膜上。 轉印膜的效果也可以與Ponceau一起使用。