在PCR引物設計中，引物上的每個鹼基是否有必要與模板鏈結合？

可以在引物中找到。

新增未配對的鹼基，但引物的 3' 端中至少有三個是緊密配對的。 然而，這種操作主要是為了新增酶切割位點或標誌。

tm 值是根據兩條鏈的退火計算的，未配對的鹼基不計算在內，因此新增未配對的鹼基對 tm 值幾乎沒有影響。

保證長度 – 無需新增未配對的鹼基。

不產生二聚體。

也沒有必要，引物本身的鹼基配對對擴增影響不大，引物之間的二聚體可以根據引物位置的選擇來避免，如果不能避免，則要保證3'端沒有配對。

因此，不建議在設計引物中新增不必要的鹼基。 （部分干擾實驗除外）。

不是引物上的每個鹼基都必須與模板鏈互補，但像圖中看到的那樣的設計是不可能的，一般引物的5'端可以與模板完全不同，這樣就可以在PCR中擁有引物酶消化位點等， 但 3' 端必須與模板鏈結合，因為 Taq 酶在 5-3 方向上延伸，如果 3' 端翹起，則無法延伸。如果引物的 3' 末端與模板下游的某處結合，則它將成為缺失片段的 PCR。

我認為沒有必要，但未配對鹼基的數量應該盡可能少，消化位點或活性位點等關鍵位置應該盡可能保守。

引物 3'末端鹼基，尤其是最後乙個和倒數第二個鹼基，應嚴格配對，避免因末端鹼基錯配導致PCR失敗。

乙個引物與靶區一端的一條DNA模板鏈互補。

引物是合成的兩段寡核苷酸組耐銀核苷酸序列，乙個引物與靶區一端的DNA模板鏈互補，另乙個引物與靶區另一端的另一DNA模板鏈互補，其功能是作為核苷酸聚合的起點， 核酸聚合酶可以從其 3 端合成一條新的核酸鏈。

PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使它們能夠有效地擴增模板DNA序列。 如前所述，引物的質量直接關係到PCR的特異性和成功。 引物的設計不可能有乙個包羅永珍的規則來確保PCR的成功，但遵循某些原則可以幫助引物的設計。

PCR引物設計原則。

1、引物長度一般為15-30bp。

引物的長度一般為15-30 bp，常用的為18-27 bp，但不應大於38 bp，因為太長會導致其伸長溫度大於74，不適合Taq DNA聚合酶反應;

2、引物GC含量一般為40%-60%。

引物的GC含量一般為40%-60%，45-55%為宜，GC含量過高或過低均不利於引發反應。 上下游引物的GC含量和TM值應保持接近;

3.引物對應的模板序列的TM值應為72左右。

tm 值約為 72 可以使復性條件達到最佳狀態，至少在 55-80 之間。 TM值的計算方法有幾種，如根據公式TM 4（G+C）2（A+T），在Oligo軟體中使用最近鄰法;

4.底漆3'端的鹼基一般不使用A。

引物 3' 端的鹼基通常不使用 A，因為 A 在錯誤的引物位點相對有效。

5.引物3'端存在3個以上連續鹼基，如GGG或CCC，也會增加出錯概率。

6.引物3'端的互補、二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。

7.如果編碼區被擴增，引物的3'端不應終止於密碼子的第3位，因為密碼子的第3位容易發生變性，會影響擴增的特異性和效率

8.底漆的5'端可以改性。

引物的5'末端序列對PCR影響不大，因此常用於引入修飾位點或標記物。

9.鹼基應隨機分布，引物本身與引物之間不應有4個連續的鹼基互補。

引物是核苷酸的一小部分。 在PCR中，兩個引物與靶DNA的2條子鏈的兩端互補，也就是說，如果你看圖的平面：乙個引物與前一條鏈的左端互補，另乙個引物與下乙個子鏈的右端互補。

所以兩個引物的順序是不一樣的，這樣就不會搞砸了。

引物的作用：引物與子鏈相互互補，單個脫氧核苷酸可以開始連線。

PCR擴增的引物分為上游和下游引物（或Senseprimer，Anti-Sense

primer),pcr

擴增的片段是 DNA 鏈上上游和下游引物截獲的片段。 上游引物與模板的5'端序列相同，下游引物與模板的3'端序成反比互補。 一般引物序列長度為18 25個鹼基。 primer5

設計。 這兩種引物共同確定PCR擴增產物的大小和位置。

PCR引物，也稱為寡核苷酸引物或RNA，是人工合成的，分為引物1和引物2兩種型別。 由於 DNA 聚合酶只能從核苷酸鏈中去除5'結束到 3'結束複製，即只能識別 3 個'並且只能將核苷酸附著在除 DNA 模板之外產生的多核苷酸鏈上，因此引物 1 和 2 位於雙鏈 DNA 兩條鏈的尾部（即末端為 3'end） 為那些脫氧核苷酸提供 3 個'相當於乙個開始。 然後在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。

而這本入門書就成為了新產業鏈的一部分。

事實上，DNA在生物體中的複製也是這樣乙個過程，但引物是由人體本身合成的。

準確地說，PCR的引物是“寡核苷酸鏈”，大約有20個核苷酸。 通常成為RNA引物。

首先合成的RNA引物成為雙鏈的一部分。

首先，您必須了解引物 3 是 DNA 合成所必需的'末端的羥基，合成方向為5'3'。

如果必須指定模板鏈和互補鏈，則將上游引物與互補鏈3'配對，使合成方向為5'3'

下游引物的3'端與模板互補，合成方向為5 3'，結果為乙個模板複製2個後代，引物之間的序列相同，半保留複製，與親代的DNA雙鏈分離。 從理論上講，它類似於裂變反應，因此PCR可以在30到40個迴圈後將痕量序列放大一百萬倍。

對於這個問題，初學者最好自己用筆在紙上畫畫，一會兒就會明白。 請注意，在繪製時，請務必清楚地標記模板鏈、互補鏈以及上游和下游引物的 3' 和 5' 端。

第一條鏈合成後，HL水解mRNA和NRVZ，水解片段作為第二條鏈的引物。

PCR反應中有兩種引物，5端引物和3引物。 引物基於單鏈DNA設計（通常基於資訊鏈），5端引物與待擴增片段5端上游的小DNA序列相同。 3 端引物與位於待擴增片段第 3 端的一小段 DNA 序列互補。

RNA引物是DNA複製所必需的，DNA複製由DNA聚合酶和RNA聚合酶的性質決定。 DNA聚合酶不能從頭合成DNA（需要引物DNA或RNA），因為DNA聚合酶具有高保真系統，這就要求在延伸新鏈的過程中，只有新新增的鹼基和模板鏈形成雙螺旋才能繼續延伸鏈，否則延伸終止， 切除修復機制啟動，直到新增正確的鹼基，即DNA聚合酶的上游位置必須相互互補，形成雙鏈（可以是RNA-DNA），才能繼續下游DNA合成，這是由其忠實性和高保真度系統決定的。另一方面，RNA聚合酶可以從頭合成RNA，合成的RNA不含模板，不需要與模板形成互補的雙螺旋結構即可繼續下游合成。

這兩種酶的不同機制決定了只有RNA引物可用於DNA複製。

PCR反應中使用的DNA引物是用化學方法人工合成的，與模板形成雙鏈後，在DNA聚合酶的作用下，鏈的延伸可以繼續。 在體內，由於DNA聚合酶的忠實性，DNA不能從頭合成，因此RNA引物只能用於延伸。

在設計引物時需要牢記很多事情，在大多數情況下，當我們知道已知的模板序列時，我們會進行PCR擴增。

該設計旨在在兩個目標之間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。 引物分析軟體將嘗試通過對每個引物設計變體使用預定值來在這兩個目標之間取得平衡。 對於設計參考，需要注意一些基本要素：

引物長度。 一般引物長度為18 30鹼基。 一般來說，引物的長度是決定引物退火溫度（tm）的最重要因素。 以下公式可用於粗略計算引物的退火溫度。

當引物長度小於 20 bp 時：[4（g+c）+2（a+t）]-5

當引物長度大於 20 bp 時：

也可以計算退火溫度的軟體程式也很多，但是計算原理會有所不同，因此有時計算值可能會略有不同。 為了優化PCR反應，使用最短的引物，確保退火溫度不低於54，以獲得最佳的效率和特異性。

引物長度的上限不是很重要，主要與反應效率有關。 由於熵，引物越長，其退火並與靶DNA結合以形成穩定的雙鏈模板以用於DNA聚合酶結合的速率就越小。

GC 內容。 一般引物序列中的G+C含量一般為40%-60%，一對引物的GC含量和TM值應協調。 如果引物有嚴重的 GC 或 AT 傾向，請在引物的 5' 端新增適量的 A、T 或 G、C 尾部。

退火溫度。 退火溫度需要比熔融溫度低5倍，如果引物鹼數小，可以適當提高退火溫度，可以增加PCR的特異性; 如果鹼基數較大，則退火溫度可適當降低，為DNA雙鏈結合。 一對引物之間的退火溫度差異4 6不會影響PCR產量，但理想情況下，一對引物退火。

溫度相同，可以在 55 到 75 之間變化。

避免放大模板的二級結構區域。

選擇擴增片段時，最好避免模板的二級結構區域。 使用相關計算機軟體可以估計目標片段的穩定二級結構，這有助於模板的選擇。 實驗表明，當待膨脹區域的自由能（g）小於該值時，放大往往不成功。

如果無法避免該區域，則使用 7-脫氮雜-2'-脫氧 GTP 代替 DGTP 進行擴增。

成功是有幫助的。

與靶DNA不匹配。

當擴增的靶DNA序列較大時，單個引物有可能與靶DNA的多個部分結合，從而產生多個條帶。 這時，需要先使用BLAST軟體進行檢測，**。

PCR引物用於PCR擴增，它們由鹼基的互補配對組成，鹼基是要擴增的DNA鏈的一部分。 因此，設計PCR引物是為了擴增鹼基片段的DNA起始部分。

使用底漆設計軟體進行設計 底漆。